COSY frente a TOCSY: Entendiendo las diferencias clave y cómo interpretar los espectros

Para el análisis estructural de moléculas orgánicas complejas y productos naturales, experimentos de RMN de correlación escalar homonuclear 2D se encuentran entre las herramientas más útiles para resolver ambigüedades causadas por la superposición de señales en espectros 1D.

Entre los más utilizados ¹H-¹H experimentos de correlación, COSY y TOCSY responden a dos preguntas diferentes pero complementarias.

COSY se utiliza principalmente para rastrear la conectividad local protón-protón a través de acoplamientos J observables, mientras que TOCSY extiende la transferencia de magnetización a través de una red de acoplamiento continua y ayuda a identificar todos los miembros observables del mismo sistema de espín.

En términos prácticos, COSY ayuda a responder "¿Qué protones están acoplados entre sí?", mientras que TOCSY ayuda a responder "¿Qué protones pertenecen al mismo sistema de espín?"

Este artículo recorre los dos experimentos desde los principios de la secuencia de pulsos hasta la interpretación práctica del espectro, explicando sus diferencias clave y cómo pueden utilizarse juntos en espectroscopia de RMN 2D.

1. Funciones principales de COSY y TOCSY

COSY, o espectroscopia de correlación, y TOCSY, o espectroscopia de correlación total, ambos utilizan acoplamiento escalar, o acoplamiento J, para proporcionar información de correlación de protones a través de enlaces químicos.

Sin embargo, el tipo de información estructural que están diseñados para revelar es diferente.

Considere una cadena de protones continuamente acoplada:

H1 → H2 → H3 → H4

COSY: Conectividad de acoplamiento local

COSY detecta principalmente acoplamientos escalares directamente observables entre pares de protones.

Las correlaciones más comunes surgen de ²J_HH y ³J_HH acoplamientos, por ejemplo:

H1 ↔ H2
H2 ↔ H3
H3 ↔ H4

Estas correlaciones por pares permiten a los investigadores construir la conectividad protónica local paso a paso.

En otras palabras, un espectro COSY es particularmente útil cuando el objetivo es reconstruir la relación secuencial entre protones vecinos o acoplados de forma detectable.

Nota: Las correlaciones COSY no se limitan a acoplamientos de dos y tres enlaces. En sistemas alílicos, sistemas aromáticos o geometrías rígidas tipo W, un acoplamiento ⁴J suficientemente fuerte, típicamente mayor a aproximadamente 1.5 Hz, también puede generar un pico cruzado COSY. Por lo tanto, la presencia de un pico cruzado por sí sola no debe tomarse como prueba de que dos núcleos son directamente adyacentes en la estructura molecular.

TOCSY: Asignación de un sistema de espín completo

TOCSY adopta un enfoque diferente.

Mediante la transferencia de magnetización a través de una red acoplada por J, los protones dentro del mismo sistema de espín continuo pueden correlacionarse incluso cuando dos protones particulares no muestran un acoplamiento directo fuerte entre sí.

Por lo tanto, su objetivo principal no es determinar la conectividad directa de cada par de protones. En cambio, TOCSY se utiliza para identificar y agrupar múltiples protones que pertenecen al mismo sistema de espín.

Por ejemplo, si H1, H2, H3 y H4 forman una red de acoplamiento continua, la magnetización puede propagarse a través de la secuencia:

H1 → H2 → H3 → H4

Como resultado, pueden aparecer correlaciones entre miembros más distantes del sistema en el espectro TOCSY.

Nota: Un sistema de espín generalmente consiste en un grupo de núcleos conectados por una vía continua de acoplamientos J suficientemente fuertes. Si el acoplamiento efectivo entre partes de una molécula se vuelve muy débil o está ausente, la transferencia de magnetización puede interrumpirse. Esto puede ocurrir cuando los grupos están separados por un carbono cuaternario, ciertas disposiciones de heteroátomos o geometrías con un ángulo diedro cercano a 90°, donde el acoplamiento se vuelve muy pequeño. El resultado es la formación de sistemas de espín relativamente independientes.

2. Principios de la secuencia de pulsos

La diferencia fundamental entre COSY y TOCSY proviene de la forma en que se maneja la transferencia de magnetización después del período de evolución indirecta, t₁.

2.1 COSY

La secuencia de pulsos COSY básica puede representarse como:

90° - t₁ - 90° - Adquisición (t₂)

El primer pulso de 90° rota la magnetización longitudinal hacia el plano transversal.

Durante el t₁ periodo de evolución, tanto el desplazamiento químico como el acoplamiento J contribuyen a la evolución de la coherencia.

El segundo pulso de 90° produce entonces transferencia de coherencia directa.

La coherencia que permanece en el núcleo original contribuye a la señal diagonal durante el periodo de adquisición t₂, mientras que la coherencia transferida a un núcleo acoplado genera un pico cruzado.

Por lo tanto, la COSY convencional registra principalmente relaciones de acoplamiento J directo por pares.

En el espectro, estas correlaciones representan comúnmente protones vecinos o protones geminales unidos al mismo carbono.

2.2 TOCSY

TOCSY introduce un periodo de mezcla de bloqueo de espín adicional después del periodo de evolución t₁.

El bloqueo de espín no es simplemente un pulso de RF largo. Por lo general, se implementa utilizando trenes de pulsos compuestos como MLEV-17 o DIPSI-2.

Durante el tiempo de mezcla, estos pulsos compuestos generan mezcla isotrópica, permitiendo que la magnetización se propague a través de una red de acoplamiento J continua.

La magnetización primero se transfiere entre protones vecinos directamente acoplados y luego puede continuar paso a paso a través del sistema:

H1 → H2 → H3 → H4

Este mecanismo de relevo permite a TOCSY correlacionar miembros más distantes del mismo sistema de espín.

Tiempo de mezcla en TOCSY

La duración del periodo de bloqueo de espín se denomina tiempo de mezcla, y es uno de los parámetros más importantes que controlan la profundidad de la transferencia de magnetización en TOCSY.

Tiempo de mezcla corto, por ejemplo de 20 a 30 ms

La transferencia de magnetización apenas ha comenzado. Las correlaciones están dominadas por protones acoplados cercanos, por lo que el espectro resultante puede parecerse a un espectro COSY.

Tiempo de mezcla moderadamente largo, por ejemplo de 60 a 100 ms

Este es un rango comúnmente útil para muchas moléculas pequeñas y productos naturales. La magnetización tiene más tiempo para propagarse a través de un sistema de espín continuo, permitiendo que miembros más distantes se correlacionen.

Tiempos de mezcla más largos

Más largo no siempre es mejor.

Aumentar el tiempo de mezcla puede permitir que la magnetización llegue a partes más distantes de la red de acoplamiento, pero los efectos de relajación y los relacionados con la RF también se vuelven cada vez más importantes.

T₂ la relajación puede reducir la intensidad de la señal, mientras que el calentamiento por RF y otros efectos experimentales pueden contribuir a la pérdida de señal o al ensanchamiento de línea. Bajo algunas condiciones experimentales y de secuencia de pulsos, los períodos de mezcla más largos también pueden aumentar los efectos de relajación no deseados o los artefactos relacionados con los pulsos.

Por esta razón, el tiempo de mezcla TOCSY óptimo debe seleccionarse de acuerdo con el tamaño molecular, la topología de acoplamiento, el comportamiento de relajación y el sistema de espín de interés.

3. Cómo interpretar espectros COSY y TOCSY

En un espectro 2D ¹H-¹H, ambos ejes representan desplazamientos químicos de protones.

Las señales a lo largo de la diagonal corresponden a resonancias observadas en el espectro de RMN de ¹H convencional de 1D.

Los picos cruzados situados lejos de la diagonal indican que la magnetización se ha transferido entre dos resonancias de protones a través de vías de acoplamiento escalar.

Dependiendo del experimento, estas correlaciones pueden representar acoplamientos directos por pares o conectividad dentro de un sistema de espín continuo.

El siguiente ejemplo utiliza acetato de n-butilo para ilustrar la interpretación práctica de los espectros COSY y TOCSY.

3.1 COSY: Construyendo la secuencia de protones paso a paso

En el acetato de n-butilo, el carbono carbonílico no tiene ningún protón unido.

Tampoco existe una vía de acoplamiento de protones continua observable entre el grupo metilo del acetilo y la cadena de n-butilo.

Por lo tanto, la cadena de n-butilo puede analizarse utilizando una estrategia de rastreo paso a paso.

• Comience con la señal de protón de campo bajo más aislada, H2 a aproximadamente 4.0 ppm.
• Siga la línea horizontal desde H2 hasta encontrar el pico cruzado H2 ↔ H3 a aproximadamente 1.6 ppm.
• A continuación, vuelva a la señal diagonal de H3 y busque su siguiente correlación vecina. Esto revela la H3 ↔ H4 pico cruzado aproximadamente en 1.4 ppm.
• Desde H4, continúe el mismo proceso para identificar la H4 ↔ H5 correlación aproximadamente en 0.9 ppm.

Siguiendo estos picos cruzados por pares individuales, la secuencia de conectividad protónica local puede reconstruirse paso a paso.

Es importante destacar que no hay correlaciones H2 ↔ H4 o H2 ↔ H5 importantes en el espectro COSY.

Esto ilustra una de las diferencias más importantes entre COSY y TOCSY. COSY revela principalmente las relaciones de acoplamiento por pares observables necesarias para construir el marco protónico local.

3.2 TOCSY: Uso de una señal de anclaje para identificar todo el sistema de espín

Para un espectro TOCSY adquirido con un tiempo de mezcla adecuado, se puede utilizar una estrategia de interpretación diferente.

• Primero, seleccione una resonancia protónica aislada como señal de anclaje. En este ejemplo, H2 aproximadamente en 4.0 ppm es un anclaje conveniente porque está bien separado de las otras señales de protones.
• A continuación, trace una línea horizontal en el desplazamiento químico de H2.
• A lo largo de esta línea, el pico diagonal de H2 aparece junto con picos cruzados que correlacionan H2 con H3, H4 y H5.
• Por el contrario, el protón metilo acetilo H1 no aparece a lo largo de este trazo.

Por lo tanto, estas señales pueden asignarse al mismo sistema de espín de n-butilo.

La ausencia de H1 en este trazo indica que el grupo metilo acetilo y los protones de n-butilo pertenecen a diferentes sistemas de espín bajo estas condiciones.

Este enfoque resulta particularmente útil para moléculas más complejas.

En péptidos, por ejemplo, una señal de amida NH o una señal de α-H puede utilizarse como anclaje. En oligosacáridos, el protón anomérico H-1 es a menudo una señal de anclaje particularmente útil.

En estos sistemas, muchas resonancias protónicas intermedias pueden solaparse dentro de una región estrecha de desplazamiento químico. Por lo tanto, una asignación COSY paso a paso puede volverse difícil o puede verse interrumpida por un solapamiento espectral severo. TOCSY puede ayudar a evitar este problema al permitir que las correlaciones se extiendan a través de la red acoplada, haciendo posible clasificar las señales en sistemas de espín incluso cuando las resonancias intermedias individuales son difíciles de distinguir.

4. COSY vs TOCSY: Diferencias clave de un vistazo

Por lo tanto, COSY y TOCSY no son experimentos que compitan entre sí.

Proporcionan diferentes niveles de información estructural y a menudo son más útiles cuando se interpretan juntos.

5. Preguntas frecuentes

1. ¿Es siempre mejor un tiempo de mezcla TOCSY más largo?

No.

Para moléculas pequeñas convencionales, 60 a 100 ms suele ser un rango razonable para comenzar las pruebas.

Para muestras más complejas, puede ser útil adquirir dos conjuntos de datos para comparar, por ejemplo, un tiempo de mezcla corto de 20 a 30 ms y un tiempo de mezcla relativamente largo de 80 a 100 ms.

Con un periodo de mezcla corto, el espectro está dominado por correlaciones entre protones cercanos. Un periodo de mezcla más largo puede revelar correlaciones más distantes dentro del mismo sistema de espín.

El valor óptimo, sin embargo, depende de varios factores experimentales, incluyendo el acoplamiento J, el comportamiento de relajación, el disolvente, la temperatura, el rendimiento de la sonda y la potencia de RF. Por lo tanto, el tiempo de mezcla debe optimizarse para la muestra y el objetivo experimental específicos en lugar de simplemente maximizarse.

2. Si no se observa ningún pico cruzado, ¿podemos concluir que dos protones no son adyacentes o no están relacionados?

No.

La ausencia de un pico cruzado visible no significa necesariamente que dos núcleos no estén relacionados.

Por ejemplo, de acuerdo con la relación de Karplus, ciertos ángulos diedros pueden reducir significativamente el ³acoplamiento J.

Un pico cruzado también puede ser difícil de observar si se encuentra cerca de la diagonal y está oscurecido por las colas diagonales.

Los protones intercambiables pueden experimentar un intercambio químico rápido, lo que resulta en un ensanchamiento significativo de la línea.

En TOCSY, un tiempo de mezcla demasiado corto también puede evitar que la magnetización llegue a los miembros más distantes del sistema de espín.

Por lo tanto, una conclusión de "sin acoplamiento" no debe basarse únicamente en la ausencia de un pico cruzado. La interpretación también debe considerar patrones de desdoblamiento 1D, datos de RMN 2D complementarios y los parámetros de adquisición utilizados para el experimento.

3. ¿Cuáles son las ventajas de los experimentos mejorados por gradiente como gCOSY y gTOCSY?

Los gradientes de campo pulsado, o PFG, pueden utilizarse para seleccionar vías específicas de transferencia de coherencia y suprimir parte del ruido t₁ y artefactos.

En comparación con ciertos experimentos convencionales de ciclo de fase, las secuencias mejoradas por gradiente también pueden reducir el número de escaneos requeridos.

La cantidad real de tiempo de instrumento ahorrado depende de la secuencia de pulsos particular y de los parámetros de adquisición.

La selección por gradiente, sin embargo, no puede compensar problemas experimentales fundamentales. Un mal ajuste de homogeneidad (shimming), una calibración de pulsos inexacta, una supresión de solvente inadecuada o un muestreo insuficiente en la dimensión indirecta aún pueden comprometer la calidad espectral. Una buena configuración experimental básica sigue siendo esencial para obtener espectros COSY y TOCSY fiables.

Elección entre COSY y TOCSY en la práctica

COSY y TOCSY forman una de las combinaciones más útiles en espectroscopia de RMN 2D.

COSY ayuda a establecer qué protones muestran relaciones de acoplamiento J observables directamente, lo que lo hace particularmente útil para rastrear la conectividad local.

TOCSY ayuda a determinar qué protones pertenecen al mismo sistema de espín, permitiendo a los investigadores agrupar resonancias relacionadas incluso cuando los picos intermedios individuales se superponen o los protones distantes no muestran una correlación directa fuerte.

La clave es definir la pregunta estructural antes de seleccionar el experimento.

Si el objetivo es rastrear una secuencia local de protones, COSY es a menudo el punto de partida natural. Si el objetivo es identificar los miembros de todo un sistema de espín acoplado, TOCSY puede proporcionar la información adicional necesaria.

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Al interpretar espectros COSY o TOCSY, la parte más difícil a menudo no es recopilar más correlaciones, sino comprender exactamente qué dice y qué no dice cada pico cruzado.