Doble resonancia electrón-electrón (DEER) en el análisis de la estructura del ADN: aplicaciones EPR (ESR)

Desde la década de 1950, cuando Watson y Crick propusieron la estructura clásica de doble hélice del ADN, el ADN ha estado en el centro de la investigación en ciencias biológicas. El número de las cuatro bases del ADN y su orden de disposición dan lugar a la diversidad de los genes, y su estructura espacial afecta la expresión genética.

Además de la estructura tradicional de doble hélice del ADN, los estudios han identificado una estructura especial de ADN de cuatro cadenas en las células humanas, el cuádruplex G, una estructura de alto nivel formada por el plegamiento de ADN o ARN rico en repeticiones en tándem de guanina (G ), que es particularmente alto en las células G que se dividen rápidamente, son particularmente abundantes en las células que se dividen rápidamente (p. ej., células cancerosas). Por lo tanto, los G-quadruplex pueden usarse como objetivos farmacológicos en la investigación contra el cáncer. El estudio de la estructura del G-quadruplex y su modo de unión a los agentes aglutinantes es importante para el diagnóstico y tratamiento de las células cancerosas.

Representación esquemática de la estructura tridimensional del G-quadruplex.
Fuente de la imagen: Wikipedia

Doble resonancia electrón-electrón (CIERVO)

El método EPR dipolar pulsado (PDEPR) se ha desarrollado como una herramienta confiable y versátil para la determinación de estructuras en biología estructural y química, proporcionando información de distancia a nanoescala mediante técnicas de PDEPR. En los estudios de estructura de G-quadruplex, la técnica DEER combinada con el etiquetado de espín dirigido al sitio (SDSL) puede distinguir los dímeros de G-quadruplex de diferentes longitudes y revelar el patrón de unión de los agentes de unión de G-quadruplex al dímero.

Diferenciación de dímeros cuádruplex G de diferentes longitudes utilizando tecnología DEER

Usando Cu(piridina)4 como etiqueta de espín para medir la distancia, el complejo Cu(piridina)4 plano tetragonal se unió covalentemente al cuádruplex G y la distancia entre dos Cu2+ paramagnéticos en el monómero cuaternario G apilado en π se midió detectando interacciones dipolo-dipolo para estudiar la formación del dímero.

[Cu2+@A4] (TTLGGG) y [Cu2+@B4] (TLGGGG) son dos oligonucleótidos con secuencias diferentes, donde L denota el ligando. Los resultados DEER de [Cu2+@A4]2 y [Cu2+@B4]2 se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. A partir de los resultados DEER, se puede obtener que en los dímeros [Cu2+@A4]2, la distancia promedio de un solo Cu2+ -Cu2+ es dA=2,55 nm, el extremo 3' del G-quadruplex forma el dímero G-quadruplex mediante apilamiento de cola, y el eje gz de dos etiquetas de espín de Cu2+ en el dímero G-quadruplex está alineado en paralelo.

La distancia de apilamiento de [Cu2+@A4]2 π es más larga (dB-dA = 0,66 nm) en comparación con los dímeros de [Cu2+@A4]2. Se confirmó que cada monómero [Cu2+@B4] contiene un tetrámero G adicional, resultado que concuerda totalmente con las distancias esperadas. Por tanto, las mediciones de distancia mediante la técnica DEER pueden distinguir dímeros G-quadruplex de diferentes longitudes.

Fig. 1 (A) El espectro diferencial de EPR pulsado (línea negra) del dímero [Cu2+@A4]2 y su correspondiente simulación (línea roja) (34 GHz, 19 K); (B) Después de la corrección de fondo, cuatro fases en el mapa de dominio de tiempo del anuncio DEER de la posición del campo (línea negra) y el mejor resultado de ajuste obtenido de PeldorFit (línea roja); (C) Distribución de distancia obtenida mediante PeldorFit (línea roja) y simulación MD (línea gris); (D) Equilibrio [Cu2+ entre @A4] monómero y [Cu2+@A4]2 dímero. (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Fig. 2 (A) Diagramas DEER en el dominio del tiempo (líneas negras) en cuatro posiciones de campo y después de la corrección de fondo [Cu2+@B4]2 y los mejores resultados de ajuste obtenidos de PeldorFit (líneas rojas); (B) [Cu2+@B4]; (C) Distribución de distancia obtenida mediante PeldorFit (línea roja) y simulación MD (línea gris). (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Sondeo del modo de unión del agente de unión del tetrámero G al dímero utilizando la técnica DEER

Muchas moléculas pequeñas y complejos metálicos, con sistemas conjugados aromáticos planos y cargas positivas, pueden unirse y estabilizar estructuras secundarias plegadas, convirtiéndose así en posibles fármacos anticancerígenos.
El clorhidrato de N, N' -bis[2-(1-piperidinil)etil]3,4,9,10-perilentetracarboxidicarbonilo (PIPER) es un conocido agente aglutinante del cuádruplex G que puede unirse y estabilizar el cuádruplex mediante apilamiento, y el modo de unión de PIPER al G-quadruplex puede investigarse mediante la técnica DEER.

La Figura 3 y la Figura 4 muestran los resultados de los experimentos de DEER con diferentes proporciones de dímero PIPER a [Cu2+@A4]2. Los resultados muestran que cuando la proporción de dímero PIPER a [Cu2+@A4]2 es 1:1 (PIPER@[Cu2+@A4]2), dP = 2,82 nm.
La mayor distancia entre Cu2+-Cu2+ en comparación con los dímeros [Cu2+@A4]2 puros (dA = 2,55 nm) indica que PIPER forma un complejo tipo sándwich con el dímero, con la molécula orgánica plana interpuesta entre las caras 3′ de las dos G. monómeros tetraméricos. Cuando la proporción de PIPER al dímero [Cu2+@A4]2 es 2:1 (2PIPER@[Cu2+@A4]2), d2P = 3,21 nm.
Una distancia de apilamiento π adicional en comparación con el dímero PIPER@[Cu2+@A4]2 ( dP = 2,82 nm ) indica la inserción de dos ligandos PIPER en el dímero de tetramero G dispuesto de cola a cola. La técnica DEER puede revelar un nuevo modo de unión de la inserción PIPER del agente de unión del tetrámero G en el dímero del tetramero G para formar complejos intercalados.

Fig. 3 (A) Espectros dipolo DEER con diferentes proporciones de PIPER y dímero [Cu2+@A4]2 (geff = 2,061); (B) Modulación DEER con diferentes proporciones de PIPER y profundidad del dímero [Cu2+@A4]2; (C) Equilibrio del dímero [Cu2+@A4]2 y PIPER@[Cu2+@A4]2, 2PIPER@[Cu2+@A4]2, PIPER@[Cu2+@A4].
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Fig. 4 (A) Espectro en el dominio del tiempo DEER de PIPER@[Cu2+@A4]2; (B) Distribución de distancia PIPER@[Cu2+@A4]2 obtenida mediante PeldorFit (línea roja) y simulación MD (línea gris); (C) Espectro en el dominio del tiempo DEER de 2PIPER@[Cu2+@A4]2; (D) Distribución de distancia 2PIPER@[Cu2+@A4]2 obtenida mediante PeldorFit (línea roja) y simulación MD (línea gris).
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Espectrómetro de resonancia paramagnética de electrones de pulso CIQTEK

El espectrómetro de resonancia paramagnética de pulso electrónico EPR100 de CIQTEK admite tecnología de resonancia de doble electrón-electrón y puede usarse para estudiar la localización estructural, la interpretación funcional, los procesos de movimiento fisiológico y la interpretación del mecanismo de acción de proteínas complejas de membrana, ADN, ARN, ácidos nucleicos y proteínas. complejos y moléculas de proteínas relacionadas que tienen funciones clave en diversas enfermedades.

Espectrómetro de resonancia paramagnética electrónica de pulso CIQTEK EPR100


DEER resultados del experimento de CIQTEK EPR100

Resultados experimentales después del procesamiento con DeerAnalysis